Prema suvremenim izvještajima, James je bio bolestan nekoliko mjeseci prije smrti, pateći od raznih simptoma uključujući bol u prsima, nedostatak zraka i probleme s probavom. Također je doživljavao razdoblja nestalnog ponašanja i depresije. 21. ožujka 1625. James je doživio teški moždani udar koji ga je ostavio paraliziranim na lijevoj strani tijela. Nije mogao govoriti ni kretati se, a stanje mu se naglo pogoršavalo.
James je preminuo šest dana kasnije, okružen obitelji i savjetnicima. Pokopan je u Westminsterskoj opatiji 5. travnja 1625. Na prijestolju ga je naslijedio njegov sin Charles I.
Iako je točan uzrok smrti nepoznat, vjeruje se da je kombinacija čimbenika doprinijela Jamesovoj smrti, uključujući njegovo pogoršanje zdravlja, moždani udar i tercijalnu aguu. Neki suvremeni izvještaji također sugeriraju da je James možda bio otrovan, ali nema konkretnih dokaza koji podupiru tu tvrdnju.